MAYALARDA GEN KLONLAMASI




Mayalardan, ozellikle, Saccharomyces cerevisiae, okaryotik hucre karakteri taşıması, laboratuarlarda kolayca uretilebilmeleri, genetik duzeyde manipulasyonların yapılabilmesi, patojenik olmaması gibi nedenlerle, uzerinde fazla calışmalar yapılmıştır. Aynı zamanda non-saccharomyces mayalar ve flamentoz mantarlarda da genetik duzeydeki araştırmalar surdurulmektedir.
S.cerevisiae, diğer maya, bakteri, virus ve okaryotiklerin bazı onemli genlerinin klonlanmasında da buyuk kolaylıklar ve yarar sağlamaktadır. Son yıllarda, insanlarda tehlikeli infeksiyonlara yol acan Hepatitis B virus’una karşı aşı hazırlamada S.cerevisiae kullanılmıştır.

MAYALARA AİT BAZI PLASMİDLER VE GENEL OZELLİKLERİ


S.cerevisiae’in ve diğer maya hucrelerinin ekserisinde doğal plasmidler bulunmaktadır. Bunlardan biri 2 mikrometre DNA plasmidi olup, yaklaşık 6300 baz cifti uzunluktadır. Buna, bakteri plasmidi selektif marker sekansları ile replikasyon orjini ilave edilerek oluşturulan hibrit rekombinant plasmid daha stabil bir karakter gosterir ve S. cerevisiae’ye kolaylıkla transforme olabilir. Başlıca suni plasmidler; (sekil 1a, 1b, 1c, 1d)

1)Maya integrasyon plasmid (Ylp) vektorleri: Bu plasmid, E.coli’ye ait pBR322 plasmidi taban olarak kullanılarak elde edilmiştir. Ylp’de pBR322’ye ait ampR geni ve replikasyon orijini ile mayaya ait bir marker gen ura3 (veya his3, leu2) bulunmaktadır
2) Maya replikasyon plasmid (YRp) vektorleri: Bu plasmid de ampR, ura3, ve ars (autonomously replicating sequence) genleri bulunmaktadır (episomal plasmid).
3)Maya sentromerik plasmid (YCp) vektorleri: Bu vektor episomal plasmide, cen3 geninin ilavesiyle elde edilmiştir. Bu plasmidin replikasyon ve segregasyonu diğerlerinden daha iyidir.
4)Ekspresyon plasmid vektorleri: yabancı genlerin maya hucresi icimde en iyi bir tarzda ekspresyonunu sağlamak icin vektorlere maya regulator genleri katılarak elde edilen suni plasmidler daha etkindirler. Bu tarzda hazırlanan bazı plazmid vektorler insan interferon geninin klonlamasında kullanılmışlardır. Boyle plasmidlere, regulator gen olarak fosfogliserate kinas-5 (PGK) geni ile pBR322’ye ait ampR genide katılmaktadır.
Mayalara ait iyi bir mekik vektorde (bifonksiyonel plasmid vektorler) pBR322’ye ait bir marker gen (ampR) ve replikasyon orijini ile mayaya ait marker genler (cen3, ura3, ars) ve replikasyon orijini bulunmaktadır. Ayrıca, kendilerine gen aktara bilmek icin de restriksiyon kesim yerine sahiptirler.

YAPAY KROMOZOM (Artificial chromosomes, ACs) VEKTORLERİ


İnsan molekuler genetiğinde son birkac yıl icinde gercekleştirilen gelişmelere bağlı olarak kosmidlerde klonlanabilen fragmentlerden daha uzun (100-200 kb ) fragmentleri klonlanabilecek vektorlere de ihtiyac duyulmuştur. Bu amacla yapay olarak ceşitli hucre kromozomlarından vektorler hazırlanmıştır. Son yıllarda maya genetiğinde gercekleştirilen başarılarla yuzlerce Kb uzunluğundaki bu yonteme Yeast Artifisial Chromosomes (YACs) adı verilmektedir. YACs’larda 0bakteriyel plazmidler bulunmaktadır, ancak farklı olarak iki maya telomeri, bir maya sentromeri, otonom olarak replike olan diziler (autonomously replicating sequences, ARS), secici markerlar ve klonlama bolgesi bulunmaktdır. (Şekil 2)
Hemen butun okaryotlarda bulunan ARS’lar replikasyon icin gerekli orijinleri sağlarlar. Bu noktalar ve parcalar iki kolun oluşumuna neden olurlar. Bir kolda bir telomer ile secici marker, diğerinde ise başka bir marker ve hem sentromer hem de telomer bulunur. Uzun DNA fragmentlerinin bu kollara eklenmesi ve maya transformasyonu ve sonrada seleksiyonu ile sentetik kromozomlar oluşur. Uzunluklarına rağmen bu fargmentler orijinal genomik DNA’nın doğru bir representasyonunu vermektedir. Kromozomlara ozgul YACkutuphaneleri sayesinde insan genomunun haritalanma calışmaları artmış bulunmaktadır. Yapay kromozomal vektorler maya kromozomlarından başka bakteri kromozomu (BAC’s), P1 bakteriyofaj turevi kromozomları (PAC’s) ve memeli kromozomları (MAC’s)’ndan oluşturulabilmektedir.



REKOMBİNANT VEKTORUN KONAKCI ORGANİZMAYA SOKULARAK KLONLANMASI


Yabancı DNA fragmentinin uygun bir vektore aktarılmasından sonraki basamak Rekombinant vektorun konakcı hucreye aktarılmasıdır. Rekombinant DNA teknolojisinde E. coli, ozellikle de K12 suş’u en cok kullanılan konakcı organizmadır. Bunun yanısıra Bacillus subtilis ve Saccharomyces cerevisiae da kullanılan organizmalardır. Ozellikle B. subtilis nonpatojen olduğundan calışmalarda oldukca guvenilir bir mikroorganizmadır. Diğer taraftan mayanın avantajı ise okaryot olması ve kulturunun kolay yapılması, son yıllarda bu organizmaya ilişkin buyuk gelişmelerin olmasıdır.
Rekombinant plazmidler oluşturmak icin bir plazmid; bakterinin parcalanması ve santrifuj edilmesi yolu ile bakteriden izole edilir. Sonra bakteriyel DNA ve debris atılır. Plazmid DNA’sı ile yabancı DNA uygun bir RE’ne maruz bırakılarak karıştırılır ve ligaz enzimi ile muamele edilirse rekombinant plazmid (chimera) oluşturulur. Sonra yabancı DNA’yı inkorpore etmeden plazmidin tekrar sirkuler hale gelmesini azaltmak icin alkalen fosfataz ile muamele edilir. Bakteri hucresi CaCl2 ile muamele edilerek bakteri membranı plazmid DNA’sına gecirgen hale getirilir. Bu yolla rekombinant plazmid DNA’sının bakteriye sokulması işlemine transformasyon adı verilir. Transformasyon sonrası transforme olmuş konakcı agar ortamında buyutulur.
Uygun koşullar altında bakteri yaklaşık her 20 dakikada bir bolunur ve birkac gun sonra milyonlarca bakteri kolonisi oluşur. Bunlar agar ortamında once farklı koloniler halindedir ancak kultur devam edince koloniler birbirlerine girerler. Burada onemli olan nokta hucrelerin her kolonisi tek bir hucreden koken alır ve bu nedenle kolonideki tum hucreler aynı genetik yapıya sahiptirler. Bunlara hucre klonu adı verilir. Klondaki her hucre sokulan aynı DNA segmentini icermektedir. Boyle bir koloni alınıp başka bir petri kabında kulture edilirse, bu yeni kulturdeki tum kolonilerde aynı DNA baz dizisini icerirler ki işte bu işlem klonlama olarak adlandırılır.(Şekil 3)
Gen klonlanmasında klonlanan DNA parcasının oluşturduğu proteinin bilinip bilinmemesi durumuna gore iki farklı strateji, iki farklı uygulama ortaya konmuştur. Bunlar kısaca şoyle ozetlenebilir;

1)Fonksiyonel klonlama; Klonlanmak istenen DNA fragmentinin kodladığı proteinin bilindiği duruma gore yapılan uygulamalardır. Genin fonksiyonuna yonelik eldeki bilgilerden yola cıkılır. Bu uygulama turunde incelemeye alınan proteinin hangi protein olduğu tanımlandıktan sonra peptit dizisine bakılarak bu proteinin amino asit yapısı belirlenebilir. Bu bilgiden hareketle soz konusu proteinin amino asitlerini kodlayan DNA’nın nukleotid diziside belirlenebilir (Şekil 4a). Ancak bazı amino asitlerin birden fazla kodon tarafından kodlandığı unutulmamalıdır. Uzerinde calışılan bir proteinin amino asitlerini kodlayan nukleotid dizisi yani DNA fragmenti sentetik olarak elde edilebilir. Sentetik yolla elde edilen bu DNA parcaları yaklaşık 17 bc uzunluğunda olup oligonukleotid prob olarak kullanılmaktadır.

2)Pozisyonel klonlama; Subkromozomal pozisyonu bilinen bir geni izole etme anlamındadır. Genin kodladığı proteinin ne olduğu bilinmediği durumlarda uygulanan bir yontem olup, bilinmeyen bir genin oncelikle gentik pozisyonuna gore lokalizasyonu yapılıp ardından klonlanmasına pozisyonel klonlama denir. Bu yontemde ilk kademe;Genetik haritalama yontemlerinde biri kullanılarak incelenen genin ilgili kromozomdaki lokalizasyonunu belirlemektir. Daha sonra flanking DNA markerleri referans noktalar olarak kullanılarak ara DNA fragmentleri fonksiyonel genin bulunmadığı acısından incelenir. Bu genlerin varlığına ip ucları hipo metilasyonlu CpG adacıklarının gorulmesi ile elde edilir. Bu yolla gen klonlanlanması yapılarak hem hastalardaki ceşitli mutasyonlar hemde nukleotid dizisi belirlenen proteinin yapı ve fonksitonu ortaya konmaktadır. (Şekil 4b ve 5)
NOT: Sonyıllarda kistik fibrozis ve norofibromatozis gibi hastalıkları oluşturan mutant genler pozisyonel klonlama ile tespit edilmiştir.

SPESİFİK DNA FRAGMENTİ İCEREN KOLONİLERİN (KLONLARIN) SECİMİ


Gen teknolojisinde klonlama yapıldıktan sonra uygulanması gereken işlem spesifik DNA dizisi iceren kolonilerin secimidir. Bu işlem birkac basamaktan oluşmaktadır:


1)Vektorlu kolonilerin secimi işlemi: Antibiyotik direncliliği tayini yada Plaka oluşumunun gozlenmesiyle vektorlu kolonilerin seciminde ilk basamak vektorun inkorpore olduğu bakteri kolonilerinin yani transformasyonun yada transfeksiyonun gercekleştiğinin belirlenmesi işlemidir. Eğer antibiyotiğe direnclilik geni taşıyan plazmid ile transformasyon gercekleşmiş ise kolonilerin antibiyotiğin bulunduğu ortamda buyumesi gereklidir. Dolayısıyla direncli koloniler aranan kolonilerdir. Antibiyotik direnclilik tayini eğer vektor olarak faj kullanılmış ise o takdirde plaka oluşumuna dikkat edilir.


2)Rekombinant vektorlu kolonilerin secimi: antibiyotik direncliliği yada Xgal testi ile koloni seciminde koloni seleksiyonu ve koloni filtre hibridizasyonu yonjtemi uygulanır.
Koloni seleksiyonu: Vektorlu kolonilerin seciminde ikinci basamak yabancı DNA’nın vektorde bulunup bulunmadığının belirlenmesidir. Plazmidin kullanıldığı kolonilerde antibiyotiğe direncliliğin gelişip gelişmediği incelenir. Orneğin; pBR322 plazmidinde eğer yabancı DNA başarılı olarak Pstl bolgesine inkorpore olmuşsa, bu bolgede bulunan ampisiline direncli genin parcalanması (inaktif olması) ve Ampisilinin bulunduğu kulturde kolonilerin buyumemesi gerekir. Bu şekilde orijinal tabakada rekombinant koloniler toplanır ve ayrı ayrı kulture edilirler. Vektor olarak faj kullanıldığında ise belirli soylar bir chromogenic madde (Xgal = 5 bromo-4 chloro-3-indoyl-beta-D-glactopyronoside) varlığında normal olarak mavi plaklar oluşturur. Ancak yabancı DNA bu renk değişiminden sorumlu gene başarılı olarak girmişse konakcı organizma Xgal’ı ayrıştırmaz kolonilerin etrafı renksiz olarak gorulur. Bu tur koloniler secilir ve saf olarak uretilir.
Koloni filtre hibridizasyonu: Bu yontemde yabancı DNA taşıyan rekombinant bakteriler nitroseluloz kağıdı ile kaplı petri besiyerinde buyutulmekte ve filtre uzerindeki yuzlerce koloni 0,5 N NaOH ile muamele edilerek bakterilerin lizis olması sağlanmaktadır. Lizis sonucunda hucre dışına cıkan DNA’nın iki sarmalı NaOH ile işlem nedeniyle birbirinden ayrılarak tek sarmallı hale gelmaktedir. Tek sarmallı DNA’nın nitroseluloz kağıdına sıkıca tutunma-bağlanma ozelliği bulunmaktadır. Filtreler daha sonra 32P ile işaretli prob DNA ve RNA ile hibridizasyona tabi tutularak hibridizasyonu sonucu otoradyografi ile gozlenmektedir. Eğer hibritleme varsa bu duyarlı film uzerinde koloni buyukluğunde siyah noktalar gozlenecektir. (Şekil 6)


SPESİFİK DNA BAZ DİZİLİ REKOMBİNANT KOLONİLERİN SECİMİ


Bu işlem 6 değişik yontemle (Genetik yontem, Komplementasyon yontemi, Immunolojik yontem, Uygun prob ile hibridizasyon, Hibrid-arrested protein translasyonu ve Elektron mikroskobu ile) gercekleştirilir.
Rekombinantların oluştuğu koloniler belirlenince, diğer basamak spesifik DNA baz dizisi iceren rekombinantların tanımlanması gerekir. Bu aşamada değişik yaklaşımlardan yararlanılır:

Genetik yaklaşım: Bu yaklaşımda uygun bir vektorle konakcıya sokulan DNA’nın ekspresyonu incelenir. Konakcı organizma olan E.coli bakterisine sokulan gen, inkorpore olan DNA’nın sentezleyebileceği ozel bir buyume faktorune gerek duyan E.coli soyunda metabolik defekt ortaya koyacaktır. Transformantlar uygun kultur ortamı kullanılarak secilebilir.

Immunolojik yaklaşım (Klon seciminde antikorların kullanımı): Bu yaklaşımdan yararlanabilmek icin inkopore olan DNA’nın oluşturduğu antijenlere karşı antikorların olması gerekir. Plastik tabaka spesifik antikorlarla kaplanarak lizise uğramış bakteriyel kolonilerin yuzeyine yavaşca uygulanır. Burada belirli bir antijen sentezleyen koloniler antikora bağlanacaktır. Antijen daha sonra radyoaktif olarak işaretlenmiş ikinci bir antikor ile muamele edilir ve otoradyografide incelenir. İnceleme sonunda belirli antijeni sentezleyen koloniler belirlenir. Orneğin; insan insulin geni bakteride klon edilmiş olsun. Yuzlerce bakteri kolonisi icinde insulin yapan koloninin olup olmadığı antikor kullanarak bulmak mumkundur. Bunu icin once insulin enjeksiyonla tavşana verilip tavşan serumundan antikor elde edilir. Ayrıca insuline ozgu elde edilen antikor proteinleri I125 izotopu ile işaretlenir. Sonra petri kabı uzerindeki bakteri kolonileri lizis edilerek icindeki tum maddelerin acığa cıkması sağlanır. Her koloni PVC yuzeyine kaplanmış antikor ile muamele edilir. Eğer kolonilerden herhangi birinde insulin yapılmışsa bu antikor ile birleşir. PVC yuzeyi I125 ile işaretli antikor ile muamele edildiğinde yalnızca insulin yapan koloniye ait olan yerlerde radyoaktivite izlenir ve koloni bulunmuşolur.
Uygun prob ile hibridizasyon: Diğer bir yaklaşım uygun bir prob’la spesifik yabancı DNA dizisinin hibridizasyonu yoluyla klonların belirlenmesidir. Koloni hibridizasyonunda nitroseluloz filtre, bakteri kolonileri yada faj plakları uzerine konur. Filtre bu kolonilerden bir miktar DNA’yı absorbe ettikten sonra DNA denature edilir ve filtre daha sonra aranan gene komplementer olan radyoaktif işaretli DNA probu ile birlikte inkube edilerek hibridizasyon gercekleştirilir. Hibridizasyon sonrası filtredeki fazla prob yıkandıktan sonra hibritleri taşıyan filtre X ışınına maruz bırakılır, koloninin pozisyonu tabaka da işaretli olarak belirlenir.

Hibrid-arrested protein translasyonu: Diğer bir yaklaşım hibrid-arrested protein translasyonu yontemidir. Bu yontemde eğer DNA baz dizisi eksprese olmuşsa klondan ekstre edilen DNA’nın in vitro translasyonu değişik yontemler aracılığıyla incelenir. Klondan ekstre edilen DNA denature dilerek, once tek sarmal hale getirilir, daha sonra dokudan elde edilen saflaştırılmamış mRNA ile karıştırılır. RNA ile DNA hibridizasyonu gercekleşir. DNA-RNA karışımı mRNA’dan protein sentezinin gercekleşmesi icin gerekli her şeyin bulunduğu tavşan retikulosit lizatı gibi bir translasyonal sisteme konulur ve sonuc gozlenir.

KLONLANAN SPESİFİK DNA FRAGMENTİNİN TANIMLANMASI


Yabancı DNA fragmenti taşıyan Rekombinant vektorlu bakteriler once uretilir. Daha sonra bakteri icindeki rekombinant vektorler bakterilerden izole edilir. Bu aşamadan sonra daha once klonlama icin kullanılmış aynı RE ile bu vektor kesilerek klonlanan DNA fragmenti vektorden ayrılır.
Klonlanan DNA fragmentinin uzunluğunun olculmesinde daha onceden uzunluğu bilinen DNA parcalarından faydalanılır. Bunlara marker DNA denir. Klonlanan DNA fragmenti ile marker DNA agaroz jelde birlikte (-) kutuptan (+) kutba doğru yurutulur. Sonucta klonlanan DNA fragmentinin uzunluğu kabaca belirlenmiş olur. Agaroz jel elektroforezi DNA parcalarını uzunluklarına (molekul ağırlıklarına) gore ayıran bir sistemdir. Kısa olanlar daha hızlı uzun olanlara ise daha yavaş hareket ederler (Şekil 7). Klonlanan DNA fragmentinin uzunluğu kendisi ile birlikte jelde yurutulmuş marker genin buyukluğune ve bc sayısına bakılarak tanımlanır.

KAYNAKLAR:


1.Molekuler Biyolojide Kullanılan Yontemler, Nobel Tıp Kitapevleri 2.Baskı, Prof. Dr. Guler Temizkan
2.Kukem Derneği Bilimsel Yayınları No:3, Biyoteknoloji (3. Baskı) Prof. Dr. Mustafa Arta, 1995, Ankara
3.Tıbbı Genetik Ders Kitabı, Guneş ve Nobel Tıp Kitapevi, Prof.Dr. Nurettin Başaran
4.Thompson & Thompson Tıbbı Genetik, Ceviren: Prof.Dr.Engin Yılmaz, Nobel Tıp Kitapevi



__________________