Gen haritalaması, genlerin kromozomlar uzerinde bulunduğu yerlerin (lokus) gosterilmesidir. Boylece insan genomunun anatomisi ortaya cıkarılır. Pekcok genin ve diğer genetik marker`larin birbirlerine gore bir kromozom boyunca diziliş sırasının haritalanmasıyla bir kromozomun haritasını veya tum genom haritasını cıkarmak mumkundur. Bu haritalama, insan vucudu fonksiyonlarının bilinmesi icin gereklidir. Boylece insan genetik hastalıklarının heterojenite ve segregasyon analizleri bu bilgiler ışığında yapılabilecek ve gen tedavisi gercekleştirilebilecektir.
Sitogenetik haritalama, genetik haritalama ve fiziksel haritalama olmak uzere temelde uc tip gen haritası vardır.
Sitogenetik haritalar, ilk olarak sitogenetik bantlama tekniklerinin oluşturulmasıyla farklı kromozomları tanımanın yanında, subkromozomal bolgelerin de ayırdedilmesiyle ortaya cıkmıştır. Bu tur haritalar duşuk rezolusyonlu (yaklasık 6Mb) olmakla birlikte genlerin ve diğer DNA dizilerinin haritalanmasında cok basit bir yontem olan kromozom in situ hibridizasyonu icin zemin hazırlamıştır. Boylece uygun koşullarda yapılan hibridizasyondan sonra elde edilen sinyal probla, tanınan DNA dizisinin bir harita lokasyonunun tanımlanması sağlanabilir. Gunumuzde in situ hibridizasyon teknikleri floresan in situ hibridizasyon olarak geliştirilmiştir. Yontem, belirli bir DNA bolgesi kullanarak tum kromozomlar icinde eşdeğer bolgeyi bulmak şeklinde uygulanır. DNA bolgesi, radyoizotopla veya floresanla işaretlendikten sonra ısıtma ve soğutma işlemlerini takiben tek iplik haline getirilir. Boyanmamış ve lam uzerinde yayılmış
fazlara uygulanır. Hazırlanan prob, fazda yer alan kromozomlardan kendi ile eşdeğer bolgesi ile birleşir (1). Floresan kullanılarak geliştirilen yeni yontemler, cok kısa surede klonlanmış DNA dizilerinin haritalamasında kullanılmaktadır. Son yıllarda birden fazla farklı renkli floresan işaretli problarla, kısa surede daha fazla bolge incelenebilmektedir. Ayrıca fenotipin, gozlemlenebilir kromozomal yeniden duzenlenmeleri ya da kromozomal eksikliklerle ilişkilendirilmesiyle de sitogenetik haritalar oluşturulabilmiştir. Bunun yanında translokasyonlar ve kromozomal delesyonlardan turemiş parcaları iceren somatik hucre hibridleriyle doğal kromozom kırık noktaları ya da radyasyon hibridleri kullanarak yapay kırık noktaları haritalanabilir. Aynı zamanda duşuk resolusyonlu fiziksel haritalar olarak da adlandırılan bu sitogenetik haritalarda cozunurluk, genellikle birkac megabaz uzunluğundadır (2). Somatik hucre hibrid calışmaları ile de, kromozomlar ve onlar uzerindeki genlerin haritalaması calışmaları yapılmıştır. En sıklıkla fare ve insan olmak uzere iki farklı tur somatik hucreler, birleştirici bir ajan veya ozel inaktif viruslar aracılığı ile birleştirilir. Farklı farklı fare insan hibrid hucre klonları elde edilir. Başlangıcta bu klonlardaki hibrid hucrelerde hem insan hem fare kromozomları bulunurken, insan kromozomlarının bazıları her klonda farklı olmak uzere selektif olarak kaybolur. Ozel bantlama yontemleri ile morfolojik olarak, fare ve insan kromozomları kolayca ayırt edildiğinden hangi kromozom kaybı ile hangi ozelliğin etkilendiği belirlenmeye calışılmıştır. Orneğin bir enzim aktivitesi acısından fare somatik hucresinde eksiklik varsa, ama hibrid hucrede bu eksiklik gozlenmi-yorsa hangi insan kromozomu uzerinde bu enzimin geninin bulunmakta olduğu belirlenmiştir. Somatik hucre hibridizasyon yontemi ile ilk gen haritalaması, timidin kinaz enzim lokusunun 17 nolu kromozom uzerinde olduğunun gosterilmesi ile gercekleştirilmiştir (3).
Genetik haritalama, kısaca genomun matematiksel analizi olarak bilinir ve genlerin kromozomlar uzerindeki lokalizasyonlarının bulunmasında molekuler biyolojik yontemler ve bir dizi karmaşık istatistiksel analizleri kullanır (4). Ozellikle genetik etyolojili hastalıkların lokalizasyonlarının saptanması alanında son derece verimli bir metod olarak karşımıza cıkmaktadır. Metod en genel anlamı ile lokalizasyonu aranan gen ile lokalizasyonu bilinen bir genetik belirleyicinin (“marker” kuşaklar arasında birlikte kalıtılması-nın test edilmesi esasına dayanır. Bilindiği gibi kromozomlar mayozda karşı karşıya gelerek parca değişimine uğrarlar (“crossing-over”. Bu parca değişimleri sırasın-da birbirine yakın genler sıklıkla bir arada giderler. Uzak yerleşimli genler ise bağımsız tertiplenme kura-lına gore rastgele olarak bir arada gidebilirler ya da ayrılırlar. Boylelikle yavru kuşaklarda ebeveynlerde olmayan yeni yapılanmalar ortaya cıkar. Bu olaya “rekombinasyon” olayı, ortaya cıkan urunlere de “rekom-binant” urunler denir (Şekil 1). Rekombinasyon kavra-mı genetik haritalama’nın kalbini oluşturur. Temel hipoaaa “eğer aradığım gen kromozom lokalizasyo-nunu bildiğim marker’a cok yakınsa mayozda birbirlerinden ayrılamayacak ve kuşaklar arasında daima marker allel ile birlikte kalıtılacaktır” şeklinde ozetlenebilir. Başka bir deyişle yavru kuşaklarda rekombinant bireylerin fazla sayıda bulunması aradığımız genden uzaklaştığımız anlamına gelecektir. Bu yolla marker allel’in yeri bilindiğine gore (orneğin 2p13 bandı) ilgilendiğimiz genin ya da hastalığın yeri de bulunmuş olacaktır.
Rekombinasyon birimi centimorgan (cM) ile ifade edilir. 1cM her 100 kişide 1 rekombinant birey olduğunun gostergesidir (1/100=0.01) ve (theta) işareti ile gosterilir. Genetik uzaklıklar fiziksel anlamda olculebilir uzaklıklar değildir. Teorik olarak iki lokus arasında 1cM’lık bir uzaklıktan soz edildiği zaman, yaklaşık 1 milyon baz ciftinden soz ediliyor demektir. Ancak bu her zaman kesin değildir. Sık rekombinasyon yapan bolgelerde (rekombinasyon hot spot’lari) 2-3 cM’lik bolgeler fiziksel anlamda bazen beklendiğinden cok daha kısa olabilirler.
Bu metod yolu ile bir gen haritalama calışmasını yapabilmek icin kuşaklar arası kalıtımı izleyebileceğimiz ailelere ihtiyac vardır. Yine hipoaaaimizi oluşturmak icin kalıtım kalıbının belirlenmesi (tek gen, kompleks, mitokondrial vs.) ve marker kavramından ne anladığımızın iyice acıklanması gerekmektedir. Genetik haritalama işlemi, farklı molekuler biyolojik yontemleri teknik olarak kullanmakla birlikte temel olarak istatistiksel bir analizdir ve tum istatistik yontemlerde olduğu gibi etkin bir genetik haritalama yapabilmek icin hipoaaae yonelik parametrelerin cok sağlam olarak belirlenmesi gerekir. Bu metod kullanılarak herhangi bir nitelik (gen, marker, hastalık gibi) haritalanmaktaysa da en geniş kullanım alanını, genetik hastalıkların haritalanması oluşturmaktadır. Bu noktada genetik etkenlere bağlı olduğunu duşunduğumuz bir hastalığın gen haritalamasını yapmak istediğimizi varsayalım ve bu işlem icin gerekli aşamalar, nedenleri ve zorunlu parametreleri uzerinde tartışalım.
1. Haritalanacak fenotipin ozellikleri iyi tanımlanmalıdır: Fenotip: Bir varlığın genler ve cevre etkileşimleri sonucu turlu metodlar ile ortaya konulabilen ozelliklerinin tumu olarak tanımlanabilir (5). Gen haritalamasının ilk aşaması haritalanacak genin, hastalığın, ya da karakterin ozelliklerinin standartlar oluşturarak saptanmasıdır. Gen harita-lama calışmalarında genellikle cok sayıda aileden toplanmış orneklere ihtiyac vardır. Bu nedenle birden fazla merkez ornek toplama işlemine katılır. Merkezler arasında fenotip karmaşası yaşandığı durumda gen haritalama calışması yapmanın imkanı yoktur. Yine psikiyatrik hastalıklar gibi hastalık spektrumunun kesinlikle belirlenemediği durum-larda gen haritalama calışmaları sıklıkla başarısız-lıkla sonuclanır.
2. Haritalamada kullanılacak metoda karar verilmeli ve kalıtım kalıbı olabildiğince kesin olarak belirlenmelidir. Kalıtım kalıbının saptanmasının gen haritalama icin secilecek metodun belirlenmesi ile cok yakın ilgisi vardır. Gen haritalama metodları başlıca iki ana gruba ayrılır.
a) Parametrik metodlar: Temel olarak Linkage (Bağlantı) analizleri olarak bilinir (Ulkemizde kullanılan terim linkaj analizidir ve metin icinde bu şekilde kullanılacaktır). Linkaj analizinin başarılı olabilmesi icin değişmez parametrelere ihtiyac vardır. Bunlar: 1- kalıtım kalıbı kesin olarak bilinmelidir; 2- uc kuşaklı geniş aileler tercih nedenidir 3- ornek toplama yaklaşımı kalıtım kalıbına gore olur. Orneğin otozomal dominant bir gen ile kalıtılan bir hastalık haritalanmak isteniyorsa ornek toparlama hasta bireyler, varsa eşleri ve tum cocukları yanısıra, normal bireylerin sadece kendileri şeklinde olmalıdır. Otozomal resesif bir hastalık soz konusu olduğu zaman ise, sıklıkla taşıyıcı olan anne-baba ve tum cocuklarının toplanması yeterlidir. Pedigri (aile ağacı) analizleri yapılmaksızın sadece sporadik vakalar uzerinden linkaj analizini uygulayabilmenin imkanı yoktur (6). Şekil 2’de otozomal dominant bir genle kalıtılan bir hastalık uzerinden linkaj analizi gorulmektedir.
b) Non-parametrik metodlar: Niteliklerin kalıtım kalıplarını belirlemek her zaman kolay değildir. Pek cok genetik nitelik cok faktorlu bir kalıtım kalıbı gosterir ve bunlar icin hipoaaa oluşturmakta zorluklar yaşanır. Yine her zaman birkac kuşağı bir arada bulmak ve orneklemek olanaksızdır. Ozellikle gec yaşta başlayan hastalıklarda genellikle onceki kuşaklar olmuştur, genc kuşaklarda ise henuz hastalık ortaya cıkmamıştır. Bu durumda, eksiklikler goz onune alınarak parametrelerden bağımsız olan non-parametrik metodlar diğer bir deyişle assosiyasyon calışmaları onerilmektedir. Asso-siyasyon calışmaları icin farklı istatistik analizler onerilmişse de bunların hemen hepsinde kuşaklar arası segregasyonun test edilmesinden cok, vaka ve kontroller arasında anlamlı fark olup olmadığı test edilmektedir. Bu metodların linkaj analizine gore avantajları: 1- Kalıtım kalıbının bilinmesine gerek yoktur 2- Ailelerden cok vakaların ve kontrollerin toplanmasına gerek vardır. Dezavantajları ise 1- Ornek sayısı cok fazla olmalıdır 2- Ozellikle kontrol grubunun oluşturulmasında cok dikkatli olunmalıdır 3- Sadece bu metoda dayalı gen bulunması maliyeti cok yuksek olan calışmalardır ve genellikle başarısızlıkla sonlan-mıştır. Şekil 3’te assosiyasyon calışmalarından anlamlı bir sonuc bulabilmek icin ideal olarak secilmesi gerekli ornek sayıları verilmiştir.
Gorulduğu gibi her iki metodun da birbirine gore avantajları ve dezavantajları vardır. Eğer lokalizasyonu tek başına ispatlayacak buyuklukte aile paneli oluşturulabilmişse ve nitelik tek gen kalıtım modellerinden birini gosteriyorsa secilecek metod tereddutsuz linkaj olmalıdır. Kompleks niteliklerde assosiyasyon metodlarından birisi secilebilir. Bu amacla gunumuzde yaygın olarak onerilen iki aşamalı bir calışma planı izlenmektir (“two stage strategy” (7). Burada genellikle buyuk aileler uzerinden tum genom taranır. Potansiyel lokus’lar saptandıktan sonra sadece ilgili kromozom bolgelerine yonelik olarak assosiyasyon calışmaları duzenlenir.
3. Haritalamada kullanılacak marker’lar (genetik belirleyiciler) doğru olarak secilmeli, mevcut gen haritaları etkin olarak kullanılmalıdır. Bu kısımda gen haritalamasında kullanılan “polimorfik marker” terimini tam olarak anlamak gereklidir. Genetik yapıdaki değişiklikler en genel anlamı ile mutasyon tanımı ile belirlenir. Mutasyonlar toplumda gorulme frekansları nadir olan (allel frekansı