Gunumuzde ilac ve biyoteknoloji sektorunde; hucreler biyofabrikalar gibi kullanılarak, hucrelere ilgili genlerin dışarıdan aktarılmasıyla buyume faktorleri, insan insulin hormonları ve antikorlar gibi hastalıkların tedavisi icin kullanılan proteinler, geleneksel yontemlere kıyasla daha yuksek verimde uretilebilmektedir. Orneğin bu sayede tum dunyadaki diyabet hastaları, insan insulin geninin tutun bitkisine aktarılmasıyla, tutun bitkisinden bol miktarda uretilebilen insan insulin hormonunu […]
Gunumuzde ilac ve biyoteknoloji sektorunde; hucreler biyofabrikalar gibi kullanılarak, hucrelere ilgili genlerin dışarıdan aktarılmasıyla buyume faktorleri, insan insulin hormonları ve antikorlar gibi hastalıkların tedavisi icin kullanılan proteinler, geleneksel yontemlere kıyasla daha yuksek verimde uretilebilmektedir. Orneğin bu sayede tum dunyadaki diyabet hastaları, insan insulin geninin tutun bitkisine aktarılmasıyla, tutun bitkisinden bol miktarda uretilebilen insan insulin hormonunu kullanmaktadır. Bu yontem geliştirilmeden once ise diyabet hastaları, domuz pankreasından elde edilen, daha maliyetli olan ve insanlarda alerjiye sebep olan insulin hormonunu kullanıyorlardı. Son yıllarda sıkca bahsedilen genetik muhendisliği yontemleri nasıl kullanılır ve hucrelerin bu proteinleri uretmesi nasıl sağlanır?
Protein uretimindeki sınırlayıcı aşama, istenilen proteini yuksek miktarda ve cozunebilir formda uretebilen bir yapının oluşturulmasıdır. Bu işlem icin, proteini kodlayan gen plazmid isimli halkasal DNA parcasının yapısına eklenir (klonlanır) ve plazmid genin hucreye aktarılması icin aracı (vektor) gorevi gorur. Protein uretimi icin genlerin bir aracıya klonlanması bazen mumkun olsa da, ozellikle insan proteinleri icin fonksiyonel anlatım gosteren gen klonlarının etkili bir şekilde uretimi ciddi bir darboğazdır. Sıklıkla, proteinlerin uretilmesi zor, karmaşık ve cok basamaklı bir işlemdir. Cunku genden proteinin uretilmesi aşamasında hata olabilir ya da protein cozunmeyen agregatlar halinde sentezlenebilir ve standart yontemlerle saflaştırılamazlar. Coğu durumda araştırmacılar klonlama aşamasına donerler ve yeni bir klonlanacak gen parcası oluştururlar, yeni bir saflaştırma yontemi kullanırlar ya da proteini farklı bir konak hucrede uretirler. Bu da genellikle yeni bir klonlama deneyinin oluşturulmasını gerektirir ve dizileme analizinin de dahil olduğu cok basamaklı bir işlemdir. Coğu araştırmacı, bir klon oluşturur, onu dener ve eğer hata meydana gelirse başa doner ve yeniden başlar. Bu nedenle, protein uretimi oldukca maliyetli ve zaman alıcıdır.
Rekombinant DNA teknolojisinin gelişimi ile protein uretim yontemleri değişti. Bu aşamadan sonra hucreye birden fazla gen duşuk maliyetle aktarılabilir hale gelmiştir ve sistemin manipulasyonu mumkundur. Cok sayıda rekombinasyon klonlama sistemi mevcut iken, Gateway sistemi adındaki yontem en yuksek oranda esnekliği gosterir. Bu sistem, protein uretimi icin hızlı ve dayanıklıdır.
Gateway sistemi, cok ceşitli konak hucre icin kullanılabilecek bir protein uretim yontemidir. Bu sistemin avantajı, sadece tek bir gen yerine eş zamanlı olarak birden fazla genden protein uretilmesinin sağlanmasıdır. Bu da yontemin başarı şansını arttırır. Ayrıca bu yontemde, deneysel calışmaların yanı sıra endustriyel olcek icin de buyuk miktarlarda protein uretmek mumkun olur.
Gateway sistemi; cok aşamalı bir klonlama yontemidir ve vektorler arasında genler transfer edilirken klasik restriksiyon enzim (DNA’yı kesen bir enzim) kesimi ve ligaz enzimlerine (DNA parcalarını birbirine bağlayan bir enzim turu) gerek duyulmaz. Bu yontemle klonlamanın avantajlarından biri de, genlerin birden fazla vektore rekombinasyon (iki DNA parcasının parca alış verişi yapması) yoluyla gecmesidir. İki tur klon Gateway yonteminde kullanılır. Bunlardan biri; Entry klonlardır ve transkripsiyonel olarak sessiz olup dizisi bilinmektedir. Ekspresyon klonu ise proteinin uretileceği yapıdır ve Entry klon ile rekombinasyon yapar. Rekombinasyon, vektorle uzerinde bulunan att bolgeleri arasında gercekleşir. Bu bolgelerin dort turu vardır. Bunlar; attP, attB, attL, ve attR’dir. Entry klonlar attL bolgelerini icerirken, ekspresyon klonlar attB bolgelerini icerir.
İstenilen proteini uretecek olan gen, ceşitli yollarla Entry klon isimli aracıya aktarılabilir. Klonlama stratejisindeki esnekliği arttırabilmek icin, Gateway rekombinasyon reaksiyonu genlerin Entry klona transferi icin kullanılabilir. Entry klon oluşturulup, dizisi onaylandığında, ikinci bir rekombinasyon reaksiyonu, ilgili geni Entry klonundan final ekspresyon klonuna aktarmak icin kullanılır. Bu transferde kullanılan vektore ise Destination vektor denir. Destination vektor proteinin uretilmesi icin gerekli butun DNA dizilerini taşır. Bu diziler; promotor (genden proteinin uretilmesi icin enzimin bağlandığı dizi), antibiyotiğe direnc geni ve plazmid replikasyon orjinleridir. İlgilenilen genin olduğu kısım Gateway kaseti icerir. Bu bolgede kloramfenikol direnc geni ve ccdB isimli toksin bulunur. Bu genlerin yanında attR rekombinasyon bolgeleri vardır. Tum kaset rekombinasyon reaksiyonuyla transfer edilir. Bu reaksiyonundan sonra final ekspresyon klonu (genin proteini ureteceği vektor), Destination vektorun tamamını icerir ve Entry klonuna yerleştirilmiş olan Gateway kaseti icerir. Destination vektordeki antibiyotiğe direnc genleri, işlem sırasında hucre populasyonundan genin aktarılamadığı hucrelerin antibiyotik varlığında elenmesini sağlar. Boylece, sadece genin aktarıldığı bir hucre topluluğu elde edilir. Bu da ekspresyon klonunun yuksek etkinlikte uretilmesini sağlar.
Genetik muhendisliği yontemlerinin gelişmesiyle birlikte gelecekte, sağlıkta ya da başka alanlarda gerekli olan tum proteinlerin daha ucuz ve fazla miktarda uretilmesi mumkun olabilir.
Gunumuzde ilac ve biyoteknoloji sektorunde; hucreler biyofabrikalar gibi kullanılarak, hucrelere ilgili genlerin dışarıdan aktarılmasıyla buyume faktorleri, insan insulin hormonları ve antikorlar gibi hastalıkların tedavisi icin kullanılan proteinler, geleneksel yontemlere kıyasla daha yuksek verimde uretilebilmektedir. Orneğin bu sayede tum dunyadaki diyabet hastaları, insan insulin geninin tutun bitkisine aktarılmasıyla, tutun bitkisinden bol miktarda uretilebilen insan insulin hormonunu kullanmaktadır. Bu yontem geliştirilmeden once ise diyabet hastaları, domuz pankreasından elde edilen, daha maliyetli olan ve insanlarda alerjiye sebep olan insulin hormonunu kullanıyorlardı. Son yıllarda sıkca bahsedilen genetik muhendisliği yontemleri nasıl kullanılır ve hucrelerin bu proteinleri uretmesi nasıl sağlanır?Protein uretimindeki sınırlayıcı aşama, istenilen proteini yuksek miktarda ve cozunebilir formda uretebilen bir yapının oluşturulmasıdır. Bu işlem icin, proteini kodlayan gen plazmid isimli halkasal DNA parcasının yapısına eklenir (klonlanır) ve plazmid genin hucreye aktarılması icin aracı (vektor) gorevi gorur. Protein uretimi icin genlerin bir aracıya klonlanması bazen mumkun olsa da, ozellikle insan proteinleri icin fonksiyonel anlatım gosteren gen klonlarının etkili bir şekilde uretimi ciddi bir darboğazdır. Sıklıkla, proteinlerin uretilmesi zor, karmaşık ve cok basamaklı bir işlemdir. Cunku genden proteinin uretilmesi aşamasında hata olabilir ya da protein cozunmeyen agregatlar halinde sentezlenebilir ve standart yontemlerle saflaştırılamazlar. Coğu durumda araştırmacılar klonlama aşamasına donerler ve yeni bir klonlanacak gen parcası oluştururlar, yeni bir saflaştırma yontemi kullanırlar ya da proteini farklı bir konak hucrede uretirler. Bu da genellikle yeni bir klonlama deneyinin oluşturulmasını gerektirir ve dizileme analizinin de dahil olduğu cok basamaklı bir işlemdir. Coğu araştırmacı, bir klon oluşturur, onu dener ve eğer hata meydana gelirse başa doner ve yeniden başlar. Bu nedenle, protein uretimi oldukca maliyetli ve zaman alıcıdır.
Rekombinant DNA teknolojisinin gelişimi ile protein uretim yontemleri değişti. Bu aşamadan sonra hucreye birden fazla gen duşuk maliyetle aktarılabilir hale gelmiştir ve sistemin manipulasyonu mumkundur. Cok sayıda rekombinasyon klonlama sistemi mevcut iken, Gateway sistemi adındaki yontem en yuksek oranda esnekliği gosterir. Bu sistem, protein uretimi icin hızlı ve dayanıklıdır.
Gateway sistemi, cok ceşitli konak hucre icin kullanılabilecek bir protein uretim yontemidir. Bu sistemin avantajı, sadece tek bir gen yerine eş zamanlı olarak birden fazla genden protein uretilmesinin sağlanmasıdır. Bu da yontemin başarı şansını arttırır. Ayrıca bu yontemde, deneysel calışmaların yanı sıra endustriyel olcek icin de buyuk miktarlarda protein uretmek mumkun olur.Gateway sistemi; cok aşamalı bir klonlama yontemidir ve vektorler arasında genler transfer edilirken klasik restriksiyon enzim (DNA’yı kesen bir enzim) kesimi ve ligaz enzimlerine (DNA parcalarını birbirine bağlayan bir enzim turu) gerek duyulmaz. Bu yontemle klonlamanın avantajlarından biri de, genlerin birden fazla vektore rekombinasyon (iki DNA parcasının parca alış verişi yapması) yoluyla gecmesidir. İki tur klon Gateway yonteminde kullanılır. Bunlardan biri; Entry klonlardır ve transkripsiyonel olarak sessiz olup dizisi bilinmektedir. Ekspresyon klonu ise proteinin uretileceği yapıdır ve Entry klon ile rekombinasyon yapar. Rekombinasyon, vektorle uzerinde bulunan att bolgeleri arasında gercekleşir. Bu bolgelerin dort turu vardır. Bunlar; attP, attB, attL, ve attR’dir. Entry klonlar attL bolgelerini icerirken, ekspresyon klonlar attB bolgelerini icerir.
İstenilen proteini uretecek olan gen, ceşitli yollarla Entry klon isimli aracıya aktarılabilir. Klonlama stratejisindeki esnekliği arttırabilmek icin, Gateway rekombinasyon reaksiyonu genlerin Entry klona transferi icin kullanılabilir. Entry klon oluşturulup, dizisi onaylandığında, ikinci bir rekombinasyon reaksiyonu, ilgili geni Entry klonundan final ekspresyon klonuna aktarmak icin kullanılır. Bu transferde kullanılan vektore ise Destination vektor denir. Destination vektor proteinin uretilmesi icin gerekli butun DNA dizilerini taşır. Bu diziler; promotor (genden proteinin uretilmesi icin enzimin bağlandığı dizi), antibiyotiğe direnc geni ve plazmid replikasyon orjinleridir. İlgilenilen genin olduğu kısım Gateway kaseti icerir. Bu bolgede kloramfenikol direnc geni ve ccdB isimli toksin bulunur. Bu genlerin yanında attR rekombinasyon bolgeleri vardır. Tum kaset rekombinasyon reaksiyonuyla transfer edilir. Bu reaksiyonundan sonra final ekspresyon klonu (genin proteini ureteceği vektor), Destination vektorun tamamını icerir ve Entry klonuna yerleştirilmiş olan Gateway kaseti icerir. Destination vektordeki antibiyotiğe direnc genleri, işlem sırasında hucre populasyonundan genin aktarılamadığı hucrelerin antibiyotik varlığında elenmesini sağlar. Boylece, sadece genin aktarıldığı bir hucre topluluğu elde edilir. Bu da ekspresyon klonunun yuksek etkinlikte uretilmesini sağlar.Genetik muhendisliği yontemlerinin gelişmesiyle birlikte gelecekte, sağlıkta ya da başka alanlarda gerekli olan tum proteinlerin daha ucuz ve fazla miktarda uretilmesi mumkun olabilir.